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WB,IH,IF,ICC实验外包服务

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品牌: 嘉美实验
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所在地: 中国
有效期至: 长期有效
最后更新: 2015-07-03 13:11
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明
 WB,IH,IF,ICC实验外包服务
【嘉美生物】即日起推出WB, IH, ICC, IF实验服务优惠活动,细则如下:
1、嘉美生物提供原装进口抗体。
   我实验室进行实验服务有若干年的历史,因此我们实验室存有大批的国外原装抗体;意味着实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵(一般都会需要2000元以上)的一抗。

2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。
3、嘉美生物免费提供WB标本所需要的蛋白保护液。

   该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。
4、实验委托者之需要提供样品,即可完成整个实验。


 热点实验服务:WB,IH,IF,ICC实验服务             热点实验服务:WB,IH,IF,ICC实验服务
 

WB实验服务案例 

一抗 目的蛋白分子量 稀释度 公司/货号 二抗 稀释度
Goat Rock1 antibody about 160 kD 1:500 SANTA,SC-6055 Rabbit Anti Goat IgG/HRP 1:40,000
Goat Rock2 antibody about 160 kD 1:500 SANTA,SC-1851 Rabbit Anti Goat IgG/HRP 1:40,000
Mouse GAPDH antibody about 37 kD 1:800 SANTA,SC-365062 Goat Anti mouse IgG/HRP 1:80,000

注:SDS-PAGE凝胶浓度为12%;
阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。
Fig 1:   

 
热点实验服务:WB,IH,IF,ICC实验服务
 
Lanes: Lane  1 Lane  2 Lane  3 Lane  4 Lane  5 Lane  6
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
Rock1 242.39 337.97 229.78 233.16 151.48 205.53
Rock2 233.48 219.11 238.76 191.61 151.18 203.66
GAPDH 160.18 130.47 141.06 156.13 147.77 151.07
样本编号 25 38 28 23 26 24

WB操作规程

一.设备和试剂
1.设备
① 电泳电源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 电泳仪及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 电转仪及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE,Catalog#88018
⑤ 滤纸
Whatman,3MM CHR

2.试剂
① 凝胶试剂(实验室常备)


试剂名称 厂家
30%丙烯酰胺溶液 SIGMA
Tris-base SIGMA
10%SDS SIGMA
10%过硫酸铵 SIGMA
TEMED SIGMA
 
 
②Total protein Extraction Kit ,ProMab•美国,Cat. No:SJ-200501  
Renewable Buffer膜再生液,ProMab•美国,Cat. No:SJ-200512
天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK),MERCK•德国,Cat. No: 444810
天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ,MERCK•德国,Cat. No:71183-3
Bradford蛋白浓度测定试剂盒,嘉美生物•中国,Cat. No:BRAKIT
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,嘉美生物•中国,Cat. No:P1001
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,嘉美生物•中国,Cat. No:P1003
③ 常用溶液及缓冲液
A.5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml:
ddH2O:1.7ml
30%丙烯酰胺溶液:0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8):0.315ml
10%SDS:25ul
10%过硫酸铵:25ul
TEMED:3ul
B.分离胶溶液配方参考表
热点实验服务:WB,IH,IF,ICC实验服务
C.电泳缓冲液,1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、1g SDS,加蒸馏水至IL,pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液,在室温下长期保存。
D.电泳转移缓冲液,1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10×的储存液,在湿温下长期保存。
E.5×样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(Ph6.8)、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝,0.9ml的蒸馏水,可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。
④ 二抗稀释液
用1%BSA-PBS(含0.05%TWEEN20)稀释。
常用Secondary Antibody :
Rabbit Anti Goat IgG/HRP,嘉美生物, SEH0103,(1:10,000~40,000)
Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,000~40,000)
Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000~100,000)
Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 000~1:10 000)

二.蛋白提取(根据样品及检测要求选取以下适当提取方法)
A-1.组织裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit,ProMab, Cat. No:SJ-200501 )
1).用剪刀剪取约0.5mg组织,置于组织匀浆器中,加入1ml 总蛋白提取液,匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后,再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次,每次3s。
3).9000rpm,离心10min,取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4).-20℃冻存。
A-2.组织裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK),MERCK,Cat. No: 444810)
1).确定缓冲液充分融解,且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2).以下组织的处理应当尽快转移到 4℃无菌器皿中,如结缔组织,脂肪 血管等,最理想的组织应当切成2到3mm的碎块,然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3).轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4).组织碎块在100×g 4℃条件下离心2分钟,小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5).加入2毫升冰冷缓冲液洗涤,重复步骤3和4洗涤,在最后的洗涤步骤之后,小心完全地除去所有的缓冲液。
6).转移适当量的细碎切块 (可能冰冻的) 到一个预冷的匀浆器。 (最好是一个玻璃或石英制品),向匀浆器中加入10ul 蛋白酶抑制剂,并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取组织块。
7).小心地匀浆组织碎块,可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体 (例如  牛的肝脏需要10 下) ,尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率,可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞,而非对组织进行支离破碎。
8).尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。 
9).在16,000 x g和4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10).丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质,此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管,无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11).放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团,使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12).在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13).使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管,无需吸入细胞残渣。
A-3.组织裂解分离提取浆/核蛋白  (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ,MERCK,Cat. No:71183-3)
1).使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积,分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2).所有蛋白体提取过程应在冰面上操作,保持蛋白的稳定性。
3).取约1~20mg适量的冻存组织置于EP管中,加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4).将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中,加入150ul NucBuster Reagent 1。
5).高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。
6).4℃,16000g离心5min。
7).移除上清液(为胞浆蛋白成分,可用于内参检测),胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃,再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8).在絮状沉淀中加入  
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9).高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。
10).4℃,16000g离心5min。
11).将上清液(核蛋白)转移至另一管,可立即使用或分装保存于-70℃。
B-1.细胞裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit,ProMab, Cat. No:SJ-200501 )
1).细胞收集好,加入1ml 总蛋白提取液,充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后,再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次,每次3s。
3).9000rpm,离心10min,取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4).-20℃冻存。
B-2.细胞裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK),MERCK,Cat. No: 444810)
1).确定缓冲液充分融解,且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2).将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3).轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4).在100×g 4℃条件下离心2分钟, 小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。 
5).加入2毫升冰冷缓冲液洗涤,重复步骤3和4洗涤,在最后的洗涤步骤之后,小心完全地除去所有的缓冲液。
6).向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul 蛋白酶抑制剂,并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取细胞。
7).小心地吹打细胞,尽可能使细胞看不见。
8).尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在 4 ℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。 
9).在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10).丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质,此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管,无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11).放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.,使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟  4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12).在16,000 x g和 4℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13).使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管,无需吸入细胞残渣。
B-3.细胞裂解分离提取浆/核蛋白  (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ,MERCK,Cat. No:71183-3)
1).使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积,分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2).所有蛋白体提取过程应在冰面上操作,保持蛋白的稳定性。
3).将细胞收集好在EP管中,加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4).将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中,加入150ul NucBuster Reagent 1。
5).高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。
6).4℃,16000g离心5min。
7).移除上清液(为胞浆蛋白成分,可用于内参检测),胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃,再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8).在絮状沉淀中加入   
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9).高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。
10).4℃,16000g离心5min。
11).将上清液(核蛋白)转移至另一管,可立即使用或分装保存于-70℃。
线粒体蛋白提取见附录1

三.蛋白浓度测定:由于采用内参照法校正,省略根据总蛋白浓度估算点样法。
 
四.SDS-PAGE电泳
1).将抗原(组织/细胞裂解液)样品体积:5×loading buffer体积=5:1,混匀,在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
2).设计加样顺序,作好实验记录,按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大体积为25µl,每个电泳道上样的最低蛋白质量(每一条蛋白质条带):0.1µg(考马斯亮蓝染色)-2ng(银染色),最高蛋白质量(蛋白质混合物):20-40µg。
3).把电泳装置与电源连接好,将电压调至200V,电流应流向阳极,待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处,关闭电源。
4).从电泳装置上卸下凝胶玻璃板,用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。

五.免疫印迹操作-转膜
1).将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中,浸泡15-20min.。
2).带上手套,裁剪好滤纸(Whatman,3MM CHR)和电转膜,滤纸和膜大小为83mm×75mm,尽量避免污染滤纸和膜,将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中,驱除留于膜上的气泡。
3).打开转移盒并放置浅盘中,用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上,海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
4).小心将凝胶放置于滤纸上,避免气泡(用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面,小心将电转膜放在胶面上,从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡,注意一定要戴手套或镊子接触膜)。
5).用去离子水清洗缓冲液槽,在缓冲液槽中放入搅拌子,将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上,关上转移盒并插入转移槽。
6).将冰盒装入缓冲液槽,注满4℃预冷的转移缓冲液。
7).将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌,连接好转移电极恒流300mA转移70min。
8).电转完毕后,将电转膜置于5%的脱脂奶粉(PBS配制)中封闭,37℃2小时或4℃过夜。

六.免疫检测
一抗与靶蛋白的结合
1).封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
2).将加样槽洗涤干净,用蒸馏水润洗,晾干,将膜用一次性手套覆盖好,按标记和实验设计切下膜条(一般为3 mm宽左右)按顺序置于加样槽中,作好实验记录,加入相应的一抗约1ml,注意保证膜的所有部分同溶液接触。
3).室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
4).弃去一抗,膜条仍置于加样槽,每个槽加2-3 mlPBST,上摇床洗涤洗涤5-10min ,换液,反复4次。
酶标记二抗与一抗的结合
1).根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度(用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释),每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4℃过夜,注意保证膜的所有部分同溶液接触。
2).弃去二抗,膜条仍置于加样槽,每个槽加2-3 mlPBST,上摇床洗涤洗涤5-10min ,换液,反复4次。

七.化学发光
将膜风干,贴在玻璃纸上,加底物,做化学发光,得到胶片。将背景较高的底片片放入PIERCE公司X光片背景去除液中,观察到理想的结果时,终止反应,用水清洗以去除不需要的背景。

八.根据实验要求可适当选择Werstern Bolt 膜再生显色法(采用Renewable Buffer膜再生液,ProMab,Cat. No:SJ-200512)
1).在完成WB的显色或化学发光检测后,将蛋白转印膜置1×PBS中漂洗5分钟。
2).弃去1×PBS,加入适量的WB膜再生液,至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗45min。
3).弃WB膜再生液,加入1×PBS在摇床上漂洗5min后,弃去1×PBS,重复3次洗涤步骤。
4).进行封闭等WB的后续操作。
 
附录1:
细胞线粒体分离实验步骤
实验试剂:嘉美生物细胞线粒体分离试剂盒   产品编号:P1004
试剂盒组成:


目录号 品名 规格
P1004-1 线粒体分离试剂 125ml
P1004-2 台盼蓝染色液 10ml
P1004-3 线粒体储存液 15ml
P1004-4 线粒体裂解液 15ml
P1004-5 PMSF(晶体) 可配制1.5ml 100mM PMSF
P1004-6 PMSF(溶剂) 1.5ml

实验步骤:
1).收集约1×106--107细胞(贴壁细胞用PBS洗一遍,胰酶消化后离心,悬浮细胞直接离心);
2).洗涤细胞:用预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,取少量细胞用于计数,剩余细胞2000rpm,4°C离心5min,弃上清。
3).预处理:加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至细胞中,轻轻悬浮细胞,冰浴放置10—15min。
4).把细胞悬液转移到玻璃匀浆中,匀浆20下左右,把细胞匀浆2000rpm,4°C离心10min。
5).小心把上清转移到另一离心管中,12000rpm,4°C离心10min。
6).小心去除上清,沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
7).在分离得到的线粒体样品中加入150—200ul临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体,裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP及线粒体中的酶活性检测。

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