细胞膜荧光探针DiD标记液

DiA，DiI，DiO，DiD和DiR染料是用于标记细胞膜和其他疏水结构的亲脂性荧光染料家族。当掺入膜中或与亲脂性生物分子如蛋白质结合时，这些对环境敏感的染料的荧光大大增强，尽管它们在水中是弱荧光的。它们具有高消光系数，极性依赖性荧光和短激发态寿命。一旦应用于细胞，这些染料在细胞质膜内横向扩散，导致整个细胞以其最佳浓度均匀染色。 DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和DiR（深红色荧光）的独特荧光颜色为活细胞的多色成像和流式细胞分析提供了便利的工具。 DiO和DiI可分别与标准FITC和TRITC过滤器一起使用。其中DiD受633 nm He-Ne激光器的激发，并且具有比DiI更长的激发和发射波长，为标记具有显着内在荧光的细胞和组织提供了有价值的替代方案。 DiR可能对体内成像或追踪有用，因为红外光通过细胞和组织的有效传播和低水平的红外线范围内的自发荧光。 操作方法 1.准备DiO，DiI DiD，DiS或DiR膜染色溶液： 1.1制备DMSO或EtOH储备溶液：储备溶液应在DMSO或EtOH中以1-5mM制备。注意：储备溶液的未使用部分应储存在-20 ℃。 避免反复冻/融循环。1.2准备工作溶液：将储备溶液（步骤1.1）稀释到合适的缓冲液中，如无血清培养基，HBSS或PBS制备1至5μM的工作溶液。注意：对于不同的细胞类型和/或实验条件，应根据经验确定工作溶液的最终浓度。 建议在至少超过十倍范围的浓度下进行测试。 2.将细胞染成悬浮液： 2.1在染料工作溶液中悬浮细胞密度为1×106 / mL（来自步骤1.2）。2.2在37°C孵育2-20分钟。 最佳孵育时间取决于细胞类型。 首先孵育20分钟，然后根据需要进行优化以获得均匀的标记。2.3将标记的悬浮管以1000至1500rpm离心5分钟。2.4取出上清液，轻轻地将细胞重新悬浮在预热（37°C）的生长培养基中。2.5按步骤2.3和2.4洗涤两次。 3.染色贴壁细胞： 3.1在无菌玻璃盖玻片上培养贴壁细胞。3.2从生长培养基中取出盖玻片，轻轻地排出多余的培养基。 将盖玻片放在湿度箱中。3.3将100μL染料工作溶液（来自步骤1.2）吸移到盖玻片的角落，轻轻搅拌直至所有细胞都被覆盖。3.4将盖玻片在37°C孵育2-20分钟。 最佳孵育时间取决于细胞类型。 首先孵育20分钟，然后根据需要进行优化以获得均匀的标记。3.5排出染料工作溶液，用生长培养基清洗盖玻片2-3次。每个洗涤循环用预热的生长培养基覆盖细胞，孵育5-10分钟后排出培养基。 4.显微镜检测： 4.1说明书中的表1总结了DiD，DiO，DiI，DiS和DiR滤波器组的选择。4.2为了同时检测多种染料，可提供如下多波段滤波器组：a）DiI和DiO = Omega XF52，Chroma 51004b）DiI和DiD = Omega XF92，Chroma 51007c）DiI，DiO和DiD = Omega XF93，Chroma 61005 5.流式细胞仪检测： 用DiO，DiI，DiD，DiS和DiR标记的细胞可分别使用常规FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测通道进行分析