蛋白磷酸化检测最新方法

蛋白磷酸化检测最新方法-详情"蛋白质磷酸化指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP的γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，而其逆向过程则是由蛋白质磷酸酶去除相应的磷酸基团。对蛋白磷酸化进行检测与表征，可更好的了解磷酸化过程及其涉及到的生理活动调控及功能。在进行蛋白磷酸化检测时，选择的方法可能会因具体样本、实验室仪器等因素而有所不同。常用的磷酸化检测方法包括32P同位素放射性标

测定磷酸化的位点

测定磷酸化的位点-详情"蛋白质磷酸化是一个通过蛋白激酶催化将ATP的磷酸基团转移到底物的氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上或者在信号作用下结合GTP的过程，其在细胞信号转到过程中起重要作用，是生物体内一种较为普遍的调节方式。磷酸化是研究较为普遍和深入的翻译后修饰，且参与多种细胞生命活动。磷酸化位点是指发生磷酸化修饰的氨基酸在蛋白质中所处的位置，可通过质谱技术（LC-MS/MS）进行测定，包括验证已知磷酸化位点

Pull-down silver stain

Pull-down silver stain-详情"银染（silver stain）是对聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质进行染色的过程，在碱性条件下，甲醛可以将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上而染色。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。Pull-down银染（Pull-down silver stain）是将Pull-down样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳分离后进行银染的过程。

Pull-down,质谱

Pull-down,质谱-详情"质谱是蛋白互相作用研究中的蛋白质“检测器”，一般的质谱技术是不能直接研究蛋白互相作用的，需要和其他技术联用检测（如常见的免疫共沉淀和Pull-down等技术），然后再分析纯蛋白或者复合蛋白样品中存在的具体蛋白，甚至于可以比较不同样本中具体蛋白的相对丰度并寻找差异蛋白。基于质谱的蛋白质检测法与传统的根据分子量鉴定的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳法（SDS-PAGE）以及依靠特异性抗体的蛋白质印

蛋白互作分析Pull-down

蛋白互作分析Pull-down-详情"Pull-down 技术又称蛋白质体外结合实验（Binding assay in vitro）， 是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，蛋白互作分析Pull-down可用于初步研究两种蛋白质的相互作用分析。Pull-down技术是通过将靶蛋白亲和固定于某种基质上作为“诱饵蛋白”，当细胞抽提液与该基质接触时，与靶蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，其他无相互作用的蛋白质则随洗脱液流出。被吸附的配体蛋白则可通过改变洗脱

蛋白纯化pull-down

蛋白纯化pull-down-详情"GST pull-down实验的基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，然后目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的较纯的目的蛋白。谷胱甘肽S转移酶（GST）是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的N-末端

HCP覆盖率检测

HCP覆盖率检测-详情"生物技术药物往往是借助工程细胞进行大规模生产，在生产过程中，这些宿主细胞会分泌其他蛋白质，伴随着细胞老化破裂产生的大量胞内蛋白等，形成与产品不相关的杂质，统称为宿主细胞蛋白质（host cell protein，HCP）。HCP的存在可能导致产品不稳定、疗效差等质量风险，还能引发病人的免疫副反应等安全风险。因此，需要证明HCP多克隆抗体能识别HCP的比例，即覆盖率（Coverage），对HCP覆盖率进行检测和评估。覆

hcp检测流程

hcp检测流程-详情"宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）是一类异质性的蛋白污染，是生物制品中无法避免的一类杂质，可能在重组发酵过程中产生，或是从外源物质引入。即使进行多次复杂的分离纯化，HCP也可能与产品共同纯化，或随产品而分离，因此需要对原料产品和下游纯化过程（DSP）中间体中的HCP进行表征和量化。在此之前，需要预先对HCP检测流程进行了解与完善，HCP检测流程主要分为以下三大部分。抗体的制备和标准品的制备：

HCP定量质谱

HCP定量质谱-详情"当前已开发出多种互补的分析用于监测宿主细胞蛋白（HCP），包括1D/2D-PAGE、基于质谱（MS）的分析技术等。如通过二维液质联用（2D-LC-MS）识别潜在的残留HCP，可以开发出基于目标的多反应监测（MRM）-LC-MS的方法来量化原液中的多个HCP。DDA蛋白质组学：采用数据依赖性采集模式（Data Dependent Acquisition，DDA）进行较高浓度的HCP检测，可以鉴定到上千个蛋白，建立数据库，同时可以得到HCP特异性肽段的离子对

HCP液质方法

HCP液质方法-详情"宿主细胞蛋白（Host cell protein, HCP）是一类与生物医药制品生产工艺有关的蛋白，会对药品的安全性及药效产生影响。HCP具有潜在的安全风险，作为生物制品中的非目标成分，HCP可能引发机体未知的免疫应答而影响生物制品的功效，甚至引起超敏反应或其他不良反应。因此，通过有效技术手段监控HCP含量是否处于安全区间内就显得尤为重要，以提高生物制品的使用安全性。随着技术的不断改进和升级，液相色谱-质谱联用

HCP残留的原因

HCP残留的原因-详情"宿主细胞蛋白(host cell protein，HCP)是指生物制品中来自生产细胞系的蛋白成分，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞分泌的促生长因子等，是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物，是一种主要的工艺相关杂质。HCP是一类异质性的蛋白污染，是生物制品中无法避免的一类杂质，可能在重组发酵过程中产生，或是从外源物质引入。HCP含量超过一定含量，很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。HCP构成了生物

HCP宿主细胞蛋白

HCP宿主细胞蛋白-详情"宿主细胞蛋白（HCP，Host Cell Protein）是在生物制药（如生产重组蛋白药物、单克隆抗体）工艺过程中所产生的杂质，其超过一定含量则很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。因此，HCP残留量检测是抗体药物产品研发与质控中zuì常进行的分析项目，HCP残留数值越低，则产品质控越好。宿主细胞蛋白（HCP）是由宿主细胞产生的与工艺相关的杂质，通常在重组生物制药产品中的含量较低，即使HCP杂质的总含量很低同

GST pull-down质谱分析

GST pull-down质谱分析-详情"GST pull-down是利用重组技术将探针蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白（glutathione-S-transferase，GST）融合，融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）稳定结合，从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。GST-pull down技术主要在体外验证能和已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质，或者两种蛋白之间是否有相互作用。其研究对象是已知蛋白质与已知蛋白质的互作验证，或者是已知

N端残基的鉴定

N端残基的鉴定-详情"氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径，N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位，其序列特异性很高，通过N端残基的鉴定可以对大多数蛋白质进行鉴定。蛋白N端测序方法主要分为两大类，即质谱技术和非质谱技术，非质谱技术主要是经典的埃德曼（Edman）降解法。质谱法（Mass spectrometry-based sequencing）是一种测量离子质荷比的分析方法。在蛋白测序方面，一级质谱主要是给出目标物的分子量

Edman反应鉴定N端残基

Edman反应鉴定N端残基-详情"Edman降解是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程，利用Edman化学反应从蛋白质的N末端将α残基依次降解再对氨基酸进行鉴定。Edman降解方法只能用于鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。该方法需要对N端α残基氨基酸进行化学修饰（苯异硫氰酸酯修饰），然后从肽上切割该氨基酸，再经层析或色谱法（如HPLC）鉴定被切割的氨基酸，余下的多肽链（少了一个残基）保持完整并被回收进行下一轮降解循

Edman降解无法测修饰

Edman降解无法测修饰-详情"翻译后修饰（PTMs）和翻译后结构的加工只能通过蛋白水平的直接分析来展现，这些对蛋白的研究是迫切需要的。相较于没有发生修饰的蛋白，PTMs会导致特定序列分子量的增加，使得蛋白水平的分析较为困难。Edman降解法（Edman degradation）可对N-末端具有游离α-残基的肽段或蛋白测序，却无法对大多数翻译后修饰的蛋白进行测序。利用Edman化学降解法测序慢，且得到的肽段序列小于60个氨基酸长度，每个氨基酸

Edman转膜PVDF步骤

Edman转膜PVDF步骤-详情"Edman降解法（Edman degradation）测序实验中，经过SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质样品需经过“转膜”步骤，从PAGE胶转移到PVDF膜上固定，才能接着使用Edman降解法进行下一步的测序。转膜是将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上，是Edman降解法测序样品准备过程，这是对zuì终的测序结果影响较大的一步，转膜质量的好坏直接决定了测序的数据分析结果。因此，Edman转膜步骤不容忽视。为了防止没有电场的情况下已经分

质谱法和Edman降解法N端测序

质谱法和Edman降解法N端测序-详情"几乎所有蛋白质合成都起始于其N-末端，其氨基酸序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着重要作用，因此蛋白质的N-末端序列分析对于生物医药等研究非常关键。蛋白质N-末端测序的两种主要方法是Edman降解（Edman degradation）和质谱法（Mass spectrometry）。质谱法将蛋白消化成5-25个氨基酸的肽，随即通过LC-MS/MS分析检测，将采集的数据与理论序列数据库进行匹配，进而确认N端序列。质谱可以测出

Edman蛋白N端测序

Edman蛋白N端测序-详情"几乎所有的蛋白质合成都起始于N-端，蛋白翻译后在细胞内会发生剪切和修饰，通常不能简单地依据基因序列对蛋白质N-端序列进行预测，而是需要对蛋白质的一级结构直接测定。因此，蛋白质N端测序分析对于生物医药等相关研究有着巨大的影响。Edman降解（Edman degradation）又称Edman测序，基于Edman降解法的蛋白质N-端测序分析是由埃德曼（P.Edman）创立的一种测定蛋白质一级结构氨基酸序列的方法。其涉及循环化

Edman化学降解的原理和反应特点

Edman化学降解的原理和反应特点-详情"Edman降解法（Edman degradation method）是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）shǒu先创立，用于肽链或蛋白质N-末端氨基酸序列分析的常用方法，其反应原理和反应特点如下所述。Edman降解法原理是异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱（TMA）条件下与蛋白质N端的α-氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-AA），然后在无水强酸（TFA）条件下，N端的第yī个残基从完整的多肽蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的