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上期给大家汇总了一些有关蛋白质测序原理的基础知识，这期着重给大家列举一些蛋白质测序实验中新手可能想问的问题，希望对网接触蛋白质测序的实验新手在选择蛋白质测序方法上有指导性帮助。
1-. 蛋白质样品纯度较高，有什么快速的蛋白质测序的方法吗？
可以通过鉴定蛋白质的肽谱图（Peptide mass fingerprinting，PMF）达到快速测定蛋白质测序的目的。因为每个蛋白质的序列是特异的，经过特定酶切产生的多肽的质量也是一定的，因此，可以利用这一特性，通过测定蛋白质酶切后产生的多肽的质量图谱，即测定蛋白质肽谱图，再与数据库蛋白质酶切的理论肽谱图进行比对，从而推断出蛋白质的序列。
2. 蛋白质肽谱图鉴定是基于哪项质谱技术？
测定肽混合物质量数有效的质谱仪是MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），灵敏度高，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的shǒu选方法。
3. 肽谱图鉴定的优缺点？
通过测定蛋白质肽谱图分析蛋白质序列的方法的优势在于此项技术只用经过以及质谱分析来对蛋白质进行分析，测定的速度较快，而且因为蛋白质序列的特异性，肽谱图法可以推断出可信度较高的蛋白质，也较为精准。但是由于肽谱图测定需要依赖数据库信息比对，因此，对于数据库不包含的蛋白质，肽谱图不能够进行准确分析。
4. 准确度高的蛋白质测序法有哪些？
虽然理论上蛋白质酶切产生的肽段图谱是特定的，但是影响蛋白质酶切，以及鉴定肽段质量的因素众多，因此，肽谱图对蛋白质测序来说还是一种比较粗略的测定方法，更为精准的蛋白质测定方法包括Edman降解测序法，串联质谱测序法等。
5. 如果蛋白样品中含有多个蛋白质，有什么方法可以一次性对所有蛋白质进行测序的吗？
MS/MS质谱鉴定可以检测一个蛋白条带中的多个蛋白质，只需要将蛋白胶切下来送测序即可，在这个过程中保证切胶使用的刀具是干净无污染的，同时避免切下旁边的杂蛋白。质谱鉴定公司会对胶样中的蛋白质进行酶切，再测定肽段序列，然后将肽段序列与已知蛋白数据库进行比对，即可获知胶样中蛋白质的ID，并推测出蛋白的序列。
6. Edman降解法能够对所有蛋白质进行测序？
Edman降解测序法的优势是能够对未知的蛋白质进行测序，目前这项技术已经近乎完善，但是Edman也有一定的局限性。例如，Edman讲解法测序不能够解决蛋白质N端环化、封闭的测序问题，另外被修饰的蛋白质不能给出确切的信号，这些都在一定程度上限制了Edman降解法的广泛应用。
7. 对未知的蛋白质来说，如果蛋白质的N端有环化封闭现象，或者N端有未知修饰时，如何对蛋白质序列进行准确分析呢？
对于序列未知的蛋白质，特别是经过改造后的重组蛋白质，体外合成蛋白质，以及改造的抗体，或者基因序列未被研究过的蛋白质，这类蛋白质的信息往往不包含在蛋白质数据库中。要实现对这类蛋白质序列的准确分析就必须通过蛋白质从头测序的方法。蛋白质从头测序法是一项基于质谱技术的分析方法。与传统质谱鉴定的方法类似，从头测序法也是先将蛋白质酶切成小的多肽片段，接着经由高效液相色谱对多肽片段进行分离，再依次通过两级质谱对多肽片段序列进行测定。相较于传统质谱测序，从头测序经过精密的算法，保证鉴定的多肽序列，能够高准确度推导的蛋白质序列，并且能够不依赖于数据库比对，实现蛋白质序列从头测定。
8. 如何对蛋白质测序结果进行验证？
如果一个蛋白质的序列被成功鉴定了，那么Western blot是很好的验证方法。由于Western blot方法的特异性和灵敏度，因此，通过Western blot验证的蛋白质几乎可以100%确定蛋白质鉴定的准确性，排出质谱鉴定的假阳性。可以选取针对蛋白质上面某一段序列制备的单克隆抗体进行检测，再将Western blot的结果与鉴定的蛋白序预计分子量进行比对，即可确定蛋白质测序结果的准确性。
9. 已知蛋白质序列，如何对蛋白质结构进行预测？
蛋白质结构预测，即从蛋白质一级结构预测它的折叠和二级，三级和四级的蛋白质结构。目前有两种常用的蛋白质结构预测的方法：1. 同源建模法，通过已知同源或同一家族中蛋白质的结构，再对目标蛋白质结构进行推测；2. 折叠识别法，通过总结已知的蛋白质折叠法作为目标蛋白质折叠的模板，再根据数据库推测出匹配的目的蛋白质折叠的过程。
讲了这么多实验新手可能会关心的有关蛋白质测序的问题，但是大家实际遇到的问题各有不同，我们在这里就挑选一下具体问题进行回答
1-. Edman降解测序是否可以测定含有大概130多个氨基酸的未知蛋白？
130个氨基酸序列比较长，已经超出了蛋白质Edman测序的限度，建议使用蛋白从头测序（de novo sequencing）对蛋白质序列进行测定。蛋白质从头测序不需要借助任何蛋白质数据库，可以对任何蛋白质，包括突变、经过生物改造的非天然蛋白质等进行测序。
2. 实验中通过Western blot鉴定出一种目的蛋白，分子量约29KD，想直接跑单向SDS-PAGE,然后切胶进行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那种更好？
使用SDS-PAGE分离，再将蛋白胶切下来做PMF是完全可行的。但是PMF比对的是肽谱图，存在一定的假阳性概率，因此对蛋白纯度的要求较高。所以，建议SDS胶跑开一些，保证切下来的蛋白胶不被其他蛋白胶影响，另外，切胶的时候注意不能被角蛋白等杂蛋白污染。PMF鉴定效率都比N端测序要更高，价格也更低。但是蛋白量、蛋白纯度足够高的话，PMF的结果也是同样可信的。
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基于生物化学、分子生物学、色谱的检测分析平台：该平台配备了Agilent 2100 生物分析仪、 ProteinSimple凝胶成像系统、高效液相色谱系统，为蛋白质组学、代谢组学分析保驾护航，包括样品制备、分离纯化、分子量测量、杂质表征表达研究等；
基于质谱技术的蛋白质组学分析平台、代谢组学分析平台、蛋白测序平台：该平台配备了超高效液相色谱质谱联用，Orbitrap Fusion Lumos Tribri，Thermo Scientific Exploris以及氢氘交换质谱仪配合机械臂为蛋白质组学、代谢组学和蛋白测序提供了全面的分析手段，包括蛋白质和代谢物的分离、质谱分析、结构分析以及动态信息研究；
生物药物表征平台： 该平台配备了DSC-FTRR差示扫描量热仪与傅立叶变换拉曼光谱仪，氢氘交换质谱仪配备机械臂，为生物药物表征提供了全面的分析手段，包括生物药物的分离、纯化、结构分析和动态信息研究；
基于10x Genomics的单细胞分析平台：该平台能够完成基于10x Genomics单细胞分析平台的检测流程，包括单细胞分选、cDNA合成、文库制备、文库质量检测、PCR扩增以及高通量测序；
基于Fluidigm的单细胞质谱流式检测平台：采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析；
基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台：基于高精度质谱的免疫多肽组学及免疫学检测平台，能够完成包括多肽分离、纯化、合成、质谱分析、免疫学检测以及分子相互作用研究；
生信云平台：基于生物信息分析方法的生信云平台，能够完成一整套的生物信息学解决方案，包括组学数据的质量分析、差异表达分析、差异表达物GO、KEGG、COG注释分析、聚类分析、相互作用网络等多层次网络和通路的分析。
一、蛋白测序
蛋白测序服务两种主要分析方法
E蛋白测序服务两种主要分析方法：Edman降解（Harvey和Ferrier，2011； Bauer等，1997）和质谱分析（MS）（Sahukar等，2016）。蛋白质测序和鉴定常用质谱法，Edman降解法是表征蛋白质N端重要的方法之一。
百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司Edman降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于Edman降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。
蛋白测序服务流程
蛋白测序服务优势
1 .采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;
2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;
3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;
4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;
5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;
6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。
二、蛋白质组学
蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。
不同技术的比较
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蛋白质组学服务 |
特点 |
技术要点 |
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Label-free |
非标蛋白质组学 |
无需对样品标记处理； 操作简单； 可大规模分析蛋白质鉴定样品，对样品数量无限制。 |
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iTRAQ/TMT |
体外标记定量蛋白质组学 |
可同时定量分析 2-10 个样品； 体外标记，不受样品类型限制； 可鉴定多达6000个蛋白； 实验稳定度和重复度较高。 |
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SILAC/Dimethyl |
体内标记定量蛋白质组学 |
可对比23 个样品； 体内标记，标记稳定，组间误差小； 需要的样本量较小，仅需几十微克的蛋白。 |
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SWATH |
DIA 全景蛋白质组学 |
全景式、高通量、非质谱依赖的数据采集手段； 数据采集精准高效，线性范围； 检测蛋白丰度跨越 4个数量级； 可分析多达 2000 个蛋白质。 |
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MRM |
绝对定量蛋白质组学 |
基于已知质谱信息来对目标分子进行分析的手段； 检测精准高效，可进行绝对定量分析； 实验结果重现性好，准确度高； 可精准鉴定低丰度蛋白。 |
蛋白质组学服务优势
1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;
2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;
3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;
4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;
5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。
三、单细胞质谱流式技术分析
单细胞质谱流式（Mass Cytometry）技术利用质谱技术对单细胞进行多参数检测，既有传统流式细胞术能够高速分析的特点，又兼并了质谱检测的高分辨能力。能够指定检测蛋白，避免漏掉丰度很低但又很重要的蛋白，且质谱流式技术通量相当高，可以实现大量细胞的检测。
百泰派克生物科技单细胞质谱流式分析方案
百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。
单细胞质谱流式服务优势
①技术先进，填补技术空白
采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。
②分析数量大，成本较低
单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。
③应用前景大
a)流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；
b)将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；
c)可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。
四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现
百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。
基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现分析策略
结果交付
1.所有鉴定的免疫多肽列表，新抗原肽以及肿瘤相关抗原肽列表；
2. 免疫多肽组数据质量分析，如研究案例中的数据报告。
五、生物药物表征
生物制药是通过现代医学研究手段结合生物生产技术研发生物医药技术产品，主要包括蛋白质、多肽、抗体、疫苗，以及生物诊断试剂等产品。近年来我国的生物医药领域一直保持着稳定发展速度，也一直占据着生物研究的热点。但是生物制品由于生物过程复杂，影响因素众多，使得生物制品在生产过程中可能引入新的杂质，或者造成生物制品本身结构性质变得不均一。这些因素可能削弱生物药物的疗效，甚至造成生物毒性和机体免疫反应等不良结果。所以生物药物在进入临床测试之前必须经过一系列严格检测来确定生物药物是否合规。百泰派克了解生物制药领域开发所面临的挑战，专注于提供完整的生物药物鉴定和分析服务。
百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。
生物药物表征服务内容
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生物药物鉴定服务 |
产品变异性分析 |
生物药物纯度分析 |
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北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP）从事以生物质谱为依托的生物药物表征，大分子物质（包括蛋白质、多肽、代谢物）质谱分析以及小分子物质检测服务。
1、公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；
2、获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；
3、业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；
4、7大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；
5、服务3000+企业，10000+客户的选择；
6、致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!
