【细胞技术】海马神经元细胞分离培养实验

仪器:CO2细胞培养箱,解剖镜,眼科镊,眼科剪

动物:新生鼠(SD大鼠)

耗材:DMEM/F12培养基、聚赖氨酸

实验步骤:

1包被:培养前一天将培养板或培养瓶或皿用0.01%多聚赖氨酸包被过夜。第二天早上来吸除包被液在无菌超净台中自然晾干后放置于培养箱中备用。

2配制神经元专用培养基(DMEM/F12培养基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%双抗)

3取脑:选取新生24h之内的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮,颅骨,用弯镊拉开脑区视野,小心取出全脑,用预冷的PBS洗数次;

4分离:以脑中线为起点,小心拨开大脑颞叶皮层,暴露出新月状海马回,小心夹出海马组织,置于预冷的PBS中,仔细剔除微血管,用眼科剪充分剪碎组织。

5消化:加入同体积0.125%的胰蛋白酶,放入培养箱中消化30分钟,期间每隔5分钟轻摇一下。

6过滤:加入数滴胎牛血清终止消化,用吸管轻轻吹打细胞数分钟,至液体成米糊状即停止吹打,动作务必轻柔,用200目细胞筛过滤收集细胞悬液。

7接种:1000rpm离心5分钟,去除上清,用DMEM/F12完全培养基重悬细胞,轻轻吹打,调整细胞浓度为100000个每毫升,接种于包被好禁止晃动;

8换液:6小时后将DMEM/F12完全培养液全量换成神经元专用培养液,第48小时后加入一定浓度的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞过度生长,随后每3天半量换液。