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1.原理:
VG染色法是利用两种阴离子染料混合或先或后作用而完成鉴别染色的。
胶原纤维呈红色(被丽春红所染)肌纤维呈黄色(被苦味酸所染),这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。组织的渗透性,取决于组织的结构密度,如细致观察,会发现组织和细胞成分都是多孔的构造。不同的组织和细胞成分,它们的空隙大小是不同的,空隙的大小,决定了组织的渗透性,如空隙小,组织结构致密,渗透性低;空隙宽,组织结构疏松,渗透性高。如已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色,则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染。由此说明红细胞对阴离子染料的渗透性最小。肌纤维与胞质次之,而胶原纤维具有最大的渗透性。
根据组织不同的渗透性能,选择分子大小不同的阴离子染料进行染色,便可把不同组织成分显示出来。染料分子的大小,主要由其分子量来体现。一般来说小分子量者易于穿透结构致密,渗透性低的组织,而大分子染料只能进入结构疏松,渗透性高的组织。常用胶原纤维染色而几种阴离子染料的分子量由小到大分别是:
苦味酸(黄色),分子量229.11
橙黄G(橙黄色)分子量452
丽春红(红色)分子量480.42
酸性品红(红色)分子量585.53
苯胺蓝(蓝色)分子量737.72
亮绿(绿色)分子量792.72
甲基蓝(蓝色)分子量799
因此,在Van Gieson氏法中,苦味酸染红细胞和肌纤维,酸性品红染胶原纤维。
2.试剂配制:
(1)Ponceau染色液:0.5%ponceau(丽春红S)水溶液10-15ml,苦味酸饱和水溶液85-90ml。
(2)Victoria Blue’B染色液:Victoria Blue’B(维多利亚蓝B)0.5g,70%乙醇100ml。
3.染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)70%乙醇稍洗后,浸入Victoria Blue’B染色液中15ml。
(3)95%乙醇中分化数秒钟。
(4)用蒸馏水洗2次
(5)用Ponceau染色液滴染5min。
(6)直接用无水乙醇分化与脱水。
(7)二甲苯透明,中性树胶封固。
(8)显微镜观察。
4.样本说明:
(1)石蜡切片
取材:1、组织离体后需及时固定;2、组织标本不宜过大、过厚。
固定:1、固定液:10%福尔马林(4%多聚.甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1～20:1;3、固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。
(2)冰冻切片
取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙.酮、95%酒精、4%多聚.甲醛等固定液中固定。
保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。
(3)细胞块石蜡切片
细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。
(4)细胞爬片
在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚.甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。
(5)细胞涂片
细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋.酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。
5.注意事项:
(1)胶原纤维切片的厚度需6um,使之对比清晰。
(2)Victoria Blue’B染色液应盛染色缸内,进行浸染色。
(3)Ponceau染色后,不能与水接触,直接用无水乙醇冲洗脱水。
(4)在Van Gieson氏染色,苦味酸与酸性品红浓的比例若不恰当,如苦味酸的浓度太高,小分子量染料苦味酸占优势,则结构致密的胞浆,肌纤维和结构疏松的胶原纤维都会被苦味酸所着染。
6.结果：
鲜红色:胶原纤维;黄色:肌纤维、细胞质、红细胞;蓝褐色:胞核
卵巢组织:胶原纤维呈红色;血管壁肌层呈黄色;细胞核呈黑色。
