串联亲和纯化/质谱（Tandem affinity purification，TAP/MS）

实验目的：寻找靶蛋白的互作蛋白

 

服务简介：
        TAP/MS是Co-IP/MS的“近亲”，两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋白以及纯化互作蛋白的原理类似。不同的是TAP/MS引入了2个纯化标签（strep或SBP，flag），2步纯化，能有效纯化裂解液中的靶蛋白及其复合物，并使非特异性蛋白的数量降至较低水平。实验组和对照组洗脱的蛋白分别做质谱，从实验组结果中扣除对照组中的蛋白，即可鉴定出与靶蛋白互作的蛋白。


技术优势：
  1、TAP/MS鉴定到的互作蛋白是细胞内与诱饵蛋白天然互作的，符合体内真实生理情况，可信度高。
  2、采用两步纯化，能有效减少非特异蛋白的结合。


服务内容:
  1、构建Flag-strep（或Flag-SBP）双标签的靶基因表达载体；
  2、包装慢病毒感染目的细胞，做成过表达细胞株，WB检测表达效果（基因大于2kb时，可能导致病毒滴度不足以感染细胞系，此时如需进行加药筛选构建稳转细胞系，则周期预计延长3-4周）；
  3、细胞总蛋白，经streptactin 树脂（或strep磁珠）和anti-flag抗体两步纯化，并洗脱；
  4、实验组和对照组的洗脱液分别用胰酶酶解；
  5、LC-MS/MS分析，获得蛋白质的定量、定性信息；
  6、实验组结果扣除对照组中的蛋白，即可得到与靶蛋白互作的蛋白。