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羊雌二醇（E2）定量检测试剂盒（ELISA）说明书
【货号】YKE60006
【产品名称】
通用名称：羊雌二醇（E2）定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称： Coat Estradiol（E2）ELISA KIT
【包装规格】
96人份/盒
【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、等相关液体中雌二醇（E2）的浓度。
【检验原理】
采用酶联免疫竞争法检测样本中雌二醇含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制成固相二抗，然后加入待测样本、辣根过氧化物酶标记雌二醇以及抗雌二醇抗体，使之形成包被二抗-抗雌二醇抗体-雌二醇（HRP）复合物，标记雌二醇的结合量与血清中的雌二醇量成反比。经显色后在酶标仪测定吸光值(OD值)，通过计算机或作图拟合浓度－吸光度曲线，反算出待测血清中雌二醇含量。
【主要组成成分】
主要成分
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组分 |
数量 |
主要成分 |
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校准品 |
0.5ml/管*6管 |
抗体配制的6个浓度标准品 |
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包被微孔板 |
96T |
预包被固相抗原 |
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HRP标记抗原 |
6mL |
HRP标记的检测抗原 |
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抗体 |
6mL |
抗雌二醇抗体 |
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底物液A |
6mL |
过氧化脲工作液 |
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底物液B |
6mL |
TMB工作液 |
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终止液 |
6mL |
2mol/L稀硫酸 |
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20×浓缩洗涤液 |
30mL |
含0.15%Tween20的PBS |
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说明书 |
1份 |
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自封袋 |
1个 |
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不干胶 |
2片 |
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校准品浓度依次为：1400、700、350、120、40、0 pg/mL。校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材
1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml量筒
7、无粉一次性乳胶手套
【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。
【适用仪器】
半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。
【样本要求】
样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
4、蛋清：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
【检验方法】
操作程序
1. 将各种试剂移至室温平衡半小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水1：20稀释，混匀后备用。
2. 将预包被板从密封袋中取出，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个校准品依次各设两3. 孔，每孔加入相应校准品50μl；其余每个检测孔直接加质控品或待测样本50μl。
4. 每孔加入酶标抗原50μl（空白对照孔除外），再按同样的顺序每孔加入抗体50μl，充分混匀，贴上封板膜，置37℃温育1小时。
5. 手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置10秒甩干，重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。
6. 每孔加显色剂A液50μl，显色剂B液50μl，振荡混匀后，置37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μl。
7.用酶标仪读数，单波长酶标仪需先用空白对照孔调零点，然后测定各孔吸光值。
【实验结果计算】
1、双波长酶标仪可以不设空白对照孔，也无需调零点。单波长酶标仪必须设空白对照孔，先用空白对照孔调零，然后测量。如没有调零，则各孔吸光值均需减去空白对照孔的吸光值。
2、计算百分结合率：用校准品或样品的OD值除以S0的OD值，为百分结合率。
3、手工作图：用百分结合率对数（logit-ln）坐标纸，以校准品浓度为横轴，以对应的百分结合率为纵轴，画出平滑直线，在曲线上按照待测血清百结合率找到浓度值。
4、计算机：由电脑计算出其浓度。
【产品性能指标】
1、外观和物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；所有组分应无包装破损。各组分装量不少于表1中要求。
2、准确性：在样本中添加高、中、低三个浓度的雌二醇制成样品，以试剂盒校准品进行分析测定，用百分结合率对数（logit-ln）拟合，要求回收率在85.0%～115.0%之间。
3、线性：用Logit-ln数学模型拟合，在40~1000pg/ml范围内，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。
4、精密度：
4.1批内精密度（CV%）应不高于10.0%；
4.2批间精密度（CV%）应不高于15.0%。
5、最低检出限：试剂盒最低检出限应不大于10 pg/ml。
6、质控血清测定值：每次检测结果均应在允许范围之内。
7、稳定性
2℃-8℃保存，有效期6个月。
8、检测范围
10pg/mL-1400pg/ml
【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。
