蛋白酶K / Proteinase K（CAS:39450-01-6)(from Tritirachium album limber)

简介

蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力。

应用 

西宝生物专业提供蛋白酶K Proteinase K（CAS:39450-01-6)，客服热线：400-021-8158。

质量指标

品名	蛋白酶 K / Proteinase K
来源	林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）
外观	白色冻干粉
比活	>30U/mg蛋白
分子量	29,730
CAS No.	39450-01-6
EC No	3.4.21.14
活性单位定义	37℃、pH 7.5条件下，每分钟可水解底物酪蛋白生成1μmol酪氨酸的蛋白酶K的量，定义为一个单位（U）。
DNase残留	以λDNA为底物，37℃消化6小时以上，未检测到脱氧核糖核酸酶活性。
RNase残留	25℃消化16小时以上，未检测到核糖核酸酶活性。
失活方法	反应体系中加入PMSF或DFP抑制剂即可失活，65℃温育10-15min可部分失活
包装	100mg，1g，10g，1kg 大包装询价

储存

干粉状态可在0~4℃条件下低温保藏。溶解后分装为适当体积，-20℃贮存。运输可在室温下进行。正确的贮存条件下，干粉状态的有效期可达一年。液体状态在-20℃有效期为半年。打开包装使用后，如果在2~8℃环境下放置超过一周时间，建议过滤除菌或增加稳定剂如0.5%叠氮化钠，防止微生物污染。

贮存和稀释缓冲液：50mM Tris-HCl缓冲液,2mM CaCl2 (pH 8.0)。
反应条件：反应缓冲液中37-56℃温育一小时

实验数据

1. 酶活测定和稳定性试验

(1) 酶活测定

试剂准备

试剂 I： 底物：1%牛奶乳酪蛋白溶液。1 g牛奶乳酪蛋白溶于50 ml 0.1 M磷酸钠盐溶液，pH 8.0，65-70 ℃水域孵育15 min搅拌溶解，自来水冷却，氢氧化钠调节pH 8.0，定容100 ml。
试剂 II： TCA溶液：0.1 M三氯乙酸，0.2 M乙酸钠，0.3 M乙酸，HCl调节pH 4.03，定容100ml。
试剂 III：0.4 M碳酸钠溶液。
试剂 IV： 福林酚试剂：用水5倍稀释。
试剂 V： 酶稀释液：0.1 M磷酸钠盐溶液，pH 8.0。
试剂 VI： 酪氨酸溶液：1 μg/ml酪氨酸，0.2 M HCl溶解。

操作步骤

1．0.5 ml试剂I 37 ℃孵育10 min，加入0.5 ml酶液，混匀，37 ℃反应10 min；
2．加入1 ml试剂II终止反应，混匀，继续孵育30 min；
3．离心反应液；
4．取0.5 ml上清液，加入2.5 ml 试剂III，0.5 ml试剂IV，混匀后37 ℃孵育30 min；
5．660 nm 测定OD1；空白对照组：0.5 ml试剂V代替酶液，测定OD2；
6．0.5 ml试剂VI，2.5 ml 试剂III，0.5 ml试剂IV，混匀后37 ℃孵育30 min。660 nm 测定OD3；
空白对照组：0.5 ml 0.2 M HCI代替试剂VI，测值为OD4。

活力计算

公式说明：
2： 反应液总体积（mL）；
0.5： 酶液体积（mL）；
10： 反应时间（min）；
df： 稀释倍数；
181.2： 酪氨酸分子量；
C： 酶浓度( mg/mL)。

结果比较

蛋白酶K特异活性
制造商	国外M品牌	Seebio
冻干产品活性 u/mg	33.5	49.5

 

(2)纯度和消化蛋白测试（SDS-PAGE）

结果: 蛋白质纯度超过 99% （激光扫描 SDS-PAGE胶）

(3) 稳定性测试：

结论：冻干粉正确储存一年内活性不变；液体酶酶活半年内降低小于5%。

2. 对比试验

以Roche蛋白酶K和seebio蛋白酶K对比。

对比反应条件：roche蛋白酶k 65℃ 10m； Seebio 蛋白酶k 65℃ 10m； Seebio蛋白酶K 55℃ 60m

以下结果QC符合要求。每管均为500ul全血。共3组对照。

实验条件	得率
ROCHE65℃10m	33ug	19.2ug	5ug
SEEBIO65℃10m	30ug	20ug	4.8ug
SEEBIO55℃60m	30.4ug	18.5ug	5.4ug

全血提取DNA试剂盒电泳图	全血提取DNA actin电泳图
日期：2010.06.09 凝胶浓度：0.7％琼脂糖RNA胶 上样量：1ug/孔 电泳条件：U=105V T=15min 1. 090826-15（roche，65℃ 10m） 2. 090826-15（seebio，65℃ 10m） 3. 090826-15（seebio，55℃ 60m） 4. 090826-17（roche，65℃ 10m） 5. 090526-17（seebio，65℃ 10m） 6. 090826-17（seebio，55℃ 60m） 7. 090826-20（roche，65℃ 10m） 8. 090826-20（seebio，65℃ 10m） 9. 090826-20（seebio，55℃ 60m）	日期：2010.06.10 凝胶浓度：0.7％琼脂糖DNA胶 上样量：10ug/孔 电泳条件：U=95V T=15min 1. 090826-15（roche，65℃ 10m） 2. 090826-15（seebio，65℃ 10m） 3. 090826-15（seebio，55℃ 60m） 4. 090826-17（roche， 65℃ 10m） 5. 090526-17（seebio， 65℃ 10m） 6. 090826-17（seebio， 55℃ 60m） 7. 090826-20（roche， 65℃ 10m） 8. 090826-20（seebio， 65℃ 10m） 9. 090826-20（seebio， 55℃ 60m） －：Negative control ＋：Positive Control

结论：SEEBIO 蛋白酶K与ROCHE蛋白酶k实验结果显示在65℃水浴10m后得率及跑胶图效果基本相同。可替代使用。

参考文献

1. Kraus, E; et.al. Proteinase K from the Mold Tritirachium album limber, Specificity and Mode of Action. Z. Physiol. Chem., 357:939; 1976.
2. Jany,KD, et al. Amino Acid Sequence of Proteinase K from the Mold, Tritirachium album limber. Proteinase K; a Subtilisin-related Enzyme with Disulfide Bonds. FEBS Letter, 199,139.1986.
3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, B.16.
4. Sweeney, P.J. and Walker, J.M. (1993) Enzymes of molecular biology. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 16, M.M. Burrell, ed., Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 305.

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