【每周优选】羊驼事件后续-Jackson二抗常见应用之多重标记（Multiple-Labeling）

上回说到，Jackson的羊驼二抗均适用于多重标记，当然，不仅仅是羊驼，Jackson还有驴、山羊、小鼠等物种，可以提供更多选择。

多重标记（Multiple-Labeling）的原理

利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时或先后采用不同的荧光色素来原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。此项技术可以在同一张切片上显示多种不同抗原成分（定性、定位、定量），因而使组织内不同抗原成分相互间功能关系的观察更为直观。

多重标记（Multiple-Labeling）的二抗选择

在多重标记（Multiple-Labeling）实验中，因为前后重染色剂间有交叉干扰，以及可能会产生的非特异性杂交，所以，二抗的选择至关重要。

荧光颜色的选择

红色和绿色的区分度较大，效果也比较理想，是最常见的两种荧光选择。绿色荧光染料通常有Cy2、FITC、Dylight 488、Alexa Flour 488，红色荧光染料则有Cy3、Rhodamine、Dylight 594、Cy5、APC等。因为绿色和红色荧光重合后显示的是黄色，而橙色、黄色、红色的光非常接近，因此三标的时候，一般选择蓝色荧光。蓝色荧光染料一般为AMCA或Dlight 405。

二抗类型的选择

因为要检测一个以上的抗原，所以二抗至少要满足以下条件：a. 不相互识别（来源于相同的物种）；b. 不识别实验系统中其他的一抗；c.不识别实验系统中其他物种的免疫球蛋白；d. 不识别样品中内源性的免疫球蛋白。Jackson可用于多重标记的荧光二抗，都经过相近物种血清吸附处理，其针对目的种属的特异性非常高，同时针对其他非目的种属的抗体分子的非特异性结合降到最低，同时避免了二抗与样本以及其它一抗的非特异性杂交。

多重标记（Multiple-Labeling）的实验示意图

以小鼠组织切片，免疫荧光三标实验为例

注意：每一步后彻底清洗，包括在第1步阻断后。在沉重的或持续的背景下，在步骤4和步骤7可能需要进一步的阻断。不要用正常血清稀释任何抗体或混合抗体以节省时间。

在这个案例中，步骤3, 6和9中使用的二抗彼此不识别，因为它们都是驴制造的。它们已经被固相吸附，使得它们不识别在步骤2, 5和8中使用的其他主抗体。此外，它们不与可能存在于小鼠组织中的内源性小鼠IgG反应。

常用的多重标记（Multiple-Labeling）二抗产品列表

备注：该表只列出了常用的用于多重标记的二抗，更多请点击这里。有“ML”标识的即为可用于多重标记实验。此处"ML"为 "Multiple-Labeling"的缩写，有不纯洁想法的请自行面壁三秒。

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