DNA提取、纯化

DNA快速提取试剂盒

应用范围

a. 石蜡包埋组织（FFPE）；

b. 人的血液（新鲜货EDTA抗凝血、血卡、带血滤纸）；

c. 口腔拭子；

d. 人的毛囊；

e. 小鼠耳片、尾巴尖；

f. 鱼鳍或鱼肉。

DNA在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。在分离DNA时遵循的原则是：保证DNA分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。1.1DNA提取与纯化  

实验流程：

客户须知：

 细菌、细胞样品需新鲜培养；动物组织、植物组织等样品取样后需液氮或-80℃速冻；提供量最低为组织：200mg；细胞：106；血液：300μl( 抗凝）；

 血液样品在4℃下可保存一周，-20℃下可保存1个月；

 服务开始前，请与我们及时沟通，以安排科学地取样及运输样本。

服务承诺：

a. 我方对实验结果以及客户所提供的资料保密，未经客户许可，我方不得将客户的实验内容、实验结果和相关信息对外公布。

b. 提供给客户DNA样品、电泳照片、OD值（1.7≤OD260/OD280≤2.0）测定结果以及详细的电子版实验流程及报告。

1.2 植物病毒的RNA提取： 

大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

材料

提纯TMV病毒液（10mg/ml）。  

操作步骤

a. 取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

b. 吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

c. 吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

d. 取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

e. 4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

f. 小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。

g. 取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意]

1、整个操作应尽可能在低温下进行。

2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

1.3动植物总RNA提取-Trizol法

材料

水稻叶片或小鼠肝组织。

操作步骤

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

a. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

b. 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

c. 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

d. 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

e. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]

a. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

b. 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

1.4 动植物mRNA提取

材料

水稻叶片或小鼠肝组织。

由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

操作步骤

a. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

b. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

c. 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

d. 将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

e. 测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

f. 测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

g. 加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。

h. 4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。 

i. 小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

j. 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

[注意]

a. mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

b. oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。 

1.5 质粒提取与纯化 

 实验流程：

客户须知：

a. 细菌、细胞样品需新鲜培养；动物组织、植物组织等样品取样后需液氮或-80℃速冻；提供量最低为组织：200mg；细胞：106；血液：300μl( 抗凝）；

b.  请提供≥100ng的质粒样品或含有目的质粒的菌种，以满足琼脂糖凝胶电泳检测及转化需要；

c. 公司只提供氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素抗生素；如果使用其它抗生素，需要您提供抗生素及抗生素的工作浓度；

d. 质粒鉴定（如酶切鉴定、PCR鉴定或测序鉴定等）费用另计；

e. 服务开始前，请与我们及时沟通，以安排科学地取样及运输样本。

服务承诺：

a. 我方对实验结果以及客户所提供的资料保密，未经客户许可，我方不得将客户的实验内容、实验结果和相关信息对外公布。

b.  提供给客户质粒（1.7≤OD260/OD280≤2.0）提取样品、电泳照片、OD值测定结果以及详细的电子版实验流程及报告。