蛋白质胶条质谱鉴定

蛋白质胶条质谱鉴定-详情蛋白质胶条鉴定蛋白质胶条是蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后所得到的相互分离的蛋白条带。在电场作用下，蛋白质在聚丙烯凝胶中按照分子量大小进行迁移，形成不同的蛋白条带，每一条蛋白条带中的蛋白质可能是相同的也可能是分子量相同或相似的不同蛋白质，可能是已知的也可能是未知的，这些蛋白胶条可以切割下来，对所含的蛋白质做进一步的鉴定，即蛋白质胶条鉴定。蛋白质胶条质

iTRAQ与Label Free

iTRAQ与Label Free-详情"蛋白质是由氨基酸组成的有机生物大分子，一切生命活动都离不开蛋白质，其在体内的动态变化过程（如种类和含量的变化）揭示了生命活动的变化过程。定量蛋白质组学就是对一个体系内所有蛋白质含量进行精确地鉴定，以揭示某项生命活动的本质。定量蛋白质组学技术可分为标记（iTRAQ等）和非标记（Label Free）两类。iTRAQiTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)是一种基于标签的蛋白质

如何查找质谱结果中的磷酸化位点

如何查找质谱结果中的磷酸化位点-详情"磷酸化蛋白组的研究内容中，位点分析是zuì重要的一个环节。不同磷酸化位点在生物学进程和分子功能上有不同的生物学意义。由于大多数磷酸化蛋白都有多个磷酸化位点，而且其磷酸化位点是可变的，所以对单一磷酸化蛋白质进行研究的传统方式，例如磷酸化抗体验证的方法显然不能满足磷酸化蛋白组的研究的多样性和复杂性，大分子生物质谱成为磷酸化蛋白鉴定zuì常用的技术手段。如何查找质谱结果中

Edman测序的局限性

Edman测序的局限性-详情"鉴定蛋白质的zuì准确方法是利用蛋白质测序方法，蛋白质测序的两种主要方法是Edman降解法和质谱法。Edman测序补充了质谱测序技术，并且在测序动物肽（无序列数据库可用）方面优于质谱测序。Edman测序的关键是试剂苯基异硫氰酸酯（PITC），其被称为Edman试剂。蛋白质的N端在未封闭的情况下，在碱性pH下PITC容易与肽的N端α残基相互作用，从而产生苯硫代氨基甲酰氨基酸衍生物。在不破坏被测序的肽中其他残基

Edman降解法测序反应条件

Edman降解法测序反应条件-详情"Edman降解（Edman degradation）法即在弱碱性条件下使蛋白质肽链N末端游离α残基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，然后用酸处理，从多肽链上仅使氨基末端残基以氨基酸的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物的形态游离出来，然后测序并进行序列分析。Edman降解法测序是通过一次次循环反应完成的，在每一轮的循环步骤中都包含偶联、裂解、转化以及氨基酸识别过程，其反应条件如下所示：偶联条件：以气态形式输送12

Edman测序法的主要原理

Edman测序法的主要原理-详情"Edman降解（Edman degradation）是从蛋白质多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程，其通过循环耦联-环化裂解-转化-PTH-氨基酸鉴定这一系列化学反应实现蛋白/多肽N端氨基酸的鉴定，深入了解Edman降解法测序的主要原理对蛋白质有序的氨基酸组成的分析具有指导意义。耦联：即在碱性环境下，Edman试剂苯基异硫氰酸酯（PITC）与蛋白质或多肽链的N末端的α-氨基反应，形成末端残基的苯硫代氨基甲酰基

Edman化学降解的原理和反应特点

Edman化学降解的原理和反应特点-详情"Edman降解法（Edman degradation method）是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）shǒu先创立，用于肽链或蛋白质N-末端氨基酸序列分析的常用方法，其反应原理和反应特点如下所述。Edman降解法原理是异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱（TMA）条件下与蛋白质N端的α-氨基偶联生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-AA），然后在无水强酸（TFA）条件下，N端的第yī个残基从完整的多肽蛋白链上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的

Edman蛋白N端测序

Edman蛋白N端测序-详情"几乎所有的蛋白质合成都起始于N-端，蛋白翻译后在细胞内会发生剪切和修饰，通常不能简单地依据基因序列对蛋白质N-端序列进行预测，而是需要对蛋白质的一级结构直接测定。因此，蛋白质N端测序分析对于生物医药等相关研究有着巨大的影响。Edman降解（Edman degradation）又称Edman测序，基于Edman降解法的蛋白质N-端测序分析是由埃德曼（P.Edman）创立的一种测定蛋白质一级结构氨基酸序列的方法。其涉及循环化

质谱法和Edman降解法N端测序

质谱法和Edman降解法N端测序-详情"几乎所有蛋白质合成都起始于其N-末端，其氨基酸序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着重要作用，因此蛋白质的N-末端序列分析对于生物医药等研究非常关键。蛋白质N-末端测序的两种主要方法是Edman降解（Edman degradation）和质谱法（Mass spectrometry）。质谱法将蛋白消化成5-25个氨基酸的肽，随即通过LC-MS/MS分析检测，将采集的数据与理论序列数据库进行匹配，进而确认N端序列。质谱可以测出

Edman转膜PVDF步骤

Edman转膜PVDF步骤-详情"Edman降解法（Edman degradation）测序实验中，经过SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质样品需经过“转膜”步骤，从PAGE胶转移到PVDF膜上固定，才能接着使用Edman降解法进行下一步的测序。转膜是将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上，是Edman降解法测序样品准备过程，这是对zuì终的测序结果影响较大的一步，转膜质量的好坏直接决定了测序的数据分析结果。因此，Edman转膜步骤不容忽视。为了防止没有电场的情况下已经分

Edman降解无法测修饰

Edman降解无法测修饰-详情"翻译后修饰（PTMs）和翻译后结构的加工只能通过蛋白水平的直接分析来展现，这些对蛋白的研究是迫切需要的。相较于没有发生修饰的蛋白，PTMs会导致特定序列分子量的增加，使得蛋白水平的分析较为困难。Edman降解法（Edman degradation）可对N-末端具有游离α-残基的肽段或蛋白测序，却无法对大多数翻译后修饰的蛋白进行测序。利用Edman化学降解法测序慢，且得到的肽段序列小于60个氨基酸长度，每个氨基酸

Edman反应鉴定N端残基

Edman反应鉴定N端残基-详情"Edman降解是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程，利用Edman化学反应从蛋白质的N末端将α残基依次降解再对氨基酸进行鉴定。Edman降解方法只能用于鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。该方法需要对N端α残基氨基酸进行化学修饰（苯异硫氰酸酯修饰），然后从肽上切割该氨基酸，再经层析或色谱法（如HPLC）鉴定被切割的氨基酸，余下的多肽链（少了一个残基）保持完整并被回收进行下一轮降解循

N端残基的鉴定

N端残基的鉴定-详情"氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径，N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位，其序列特异性很高，通过N端残基的鉴定可以对大多数蛋白质进行鉴定。蛋白N端测序方法主要分为两大类，即质谱技术和非质谱技术，非质谱技术主要是经典的埃德曼（Edman）降解法。质谱法（Mass spectrometry-based sequencing）是一种测量离子质荷比的分析方法。在蛋白测序方面，一级质谱主要是给出目标物的分子量

GST pull-down质谱分析

GST pull-down质谱分析-详情"GST pull-down是利用重组技术将探针蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白（glutathione-S-transferase，GST）融合，融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）稳定结合，从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。GST-pull down技术主要在体外验证能和已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质，或者两种蛋白之间是否有相互作用。其研究对象是已知蛋白质与已知蛋白质的互作验证，或者是已知

HCP宿主细胞蛋白

HCP宿主细胞蛋白-详情"宿主细胞蛋白（HCP，Host Cell Protein）是在生物制药（如生产重组蛋白药物、单克隆抗体）工艺过程中所产生的杂质，其超过一定含量则很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。因此，HCP残留量检测是抗体药物产品研发与质控中zuì常进行的分析项目，HCP残留数值越低，则产品质控越好。宿主细胞蛋白（HCP）是由宿主细胞产生的与工艺相关的杂质，通常在重组生物制药产品中的含量较低，即使HCP杂质的总含量很低同

HCP残留的原因

HCP残留的原因-详情"宿主细胞蛋白(host cell protein，HCP)是指生物制品中来自生产细胞系的蛋白成分，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞分泌的促生长因子等，是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物，是一种主要的工艺相关杂质。HCP是一类异质性的蛋白污染，是生物制品中无法避免的一类杂质，可能在重组发酵过程中产生，或是从外源物质引入。HCP含量超过一定含量，很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。HCP构成了生物

HCP液质方法

HCP液质方法-详情"宿主细胞蛋白（Host cell protein, HCP）是一类与生物医药制品生产工艺有关的蛋白，会对药品的安全性及药效产生影响。HCP具有潜在的安全风险，作为生物制品中的非目标成分，HCP可能引发机体未知的免疫应答而影响生物制品的功效，甚至引起超敏反应或其他不良反应。因此，通过有效技术手段监控HCP含量是否处于安全区间内就显得尤为重要，以提高生物制品的使用安全性。随着技术的不断改进和升级，液相色谱-质谱联用

HCP定量质谱

HCP定量质谱-详情"当前已开发出多种互补的分析用于监测宿主细胞蛋白（HCP），包括1D/2D-PAGE、基于质谱（MS）的分析技术等。如通过二维液质联用（2D-LC-MS）识别潜在的残留HCP，可以开发出基于目标的多反应监测（MRM）-LC-MS的方法来量化原液中的多个HCP。DDA蛋白质组学：采用数据依赖性采集模式（Data Dependent Acquisition，DDA）进行较高浓度的HCP检测，可以鉴定到上千个蛋白，建立数据库，同时可以得到HCP特异性肽段的离子对

hcp检测流程

hcp检测流程-详情"宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）是一类异质性的蛋白污染，是生物制品中无法避免的一类杂质，可能在重组发酵过程中产生，或是从外源物质引入。即使进行多次复杂的分离纯化，HCP也可能与产品共同纯化，或随产品而分离，因此需要对原料产品和下游纯化过程（DSP）中间体中的HCP进行表征和量化。在此之前，需要预先对HCP检测流程进行了解与完善，HCP检测流程主要分为以下三大部分。抗体的制备和标准品的制备：

HCP覆盖率检测

HCP覆盖率检测-详情"生物技术药物往往是借助工程细胞进行大规模生产，在生产过程中，这些宿主细胞会分泌其他蛋白质，伴随着细胞老化破裂产生的大量胞内蛋白等，形成与产品不相关的杂质，统称为宿主细胞蛋白质（host cell protein，HCP）。HCP的存在可能导致产品不稳定、疗效差等质量风险，还能引发病人的免疫副反应等安全风险。因此，需要证明HCP多克隆抗体能识别HCP的比例，即覆盖率（Coverage），对HCP覆盖率进行检测和评估。覆